Preparação de amostras para sequenciamento

QUALIDADE E CONCENTRAÇÃO DE AMOSTRAS

Podem ser utilizadas como amostras para o sequenciamento tanto produtos de PCR quanto plasmídeos. Em ambos os casos a qualidade da amostra é essencial para a obtenção de uma sequência de alta qualidade. Para isto, o ideal é que em ambos os casos as amostras sejam previamente analisadas por eletroforese em gel de agarose para verificar se há degradação e, para produtos de PCR, se somente uma banda está presente.

Se a PCR não estiver específica (ou seja, se múltiplas bandas estiverem presentes) os produtos inespecíficos poderão interferir durante o sequenciamento, logo, as condições da PCR deverão ser modificadas até que somente o produto desejado seja amplificado. Alternativamente, pode-se extrair somente a banda desejada do gel, através do uso de kits de purificação específicos para este fim.
A purificação dos produtos de PCR, independentemente da presença de bandas inespecíficas, deve ser realizada e visa retirar dímeros de primer, nucleotídeos não incorporados e demais produtos não utilizados durante a reação. Esta purificação deve ser feita com Kits comerciais ou métodos enzimáticos como o Exo-Sap.

Após a purificação dos produtos de PCR ou da extração plasmidial, é necessário fazer a quantificação dos mesmos. Recomendamos que a concentração seja estimada em gel de agarose utilizando um marcador específico ou através de espectrofotometria. Além disso, é muito importante verificar a qualidade da amostra, sendo que a relação das absorbâncias em 260/280 deve ser maior que 1,7 e 1,8 e a 260/230 maior que 2.

Após a quantificação, as amostras deverão ser amplificadas pelo método de Sanger, segundo o POP 031 – Reação para sequenciamento no Sequenciador Automatizado de DNA ABI3500, e posteriormente purificadas, segundo o POP 032 – Reação de precipitação com etanol.EDTA para sequenciamento no Sequenciador Automatizado de DNA ABI3500. Só então as amostras deverão ser submetidas ao LAMEB.